产品货号：
KL230228
中文名称：
eccDNA纯化试剂盒
英文名称：
eccDNA Purification Kit
产品规格：
50T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是测序级的以粗提eccDNA为起始材料的eccDNA纯化试剂盒，能有效分离eccDNA和非eccDNA，采用酶切去除人线粒体DNA，降低其对eccDNA分析的干扰，纯化后的eccDNA跟后续的酶切电泳，核酸扩增等研究兼容。
| 组分 | 规格 | 保存 |
| 去蛋白溶液A | 50mL | 室温 |
| 去蛋白溶液B | 50mL | |
| 微量核酸沉淀剂V2.0 （无生物源性） | 200mL | |
| 10×人mtDNA内切酶缓冲液 | 1mL | -20℃ |
| 人mtDNA内切酶 | 50μL |
保存：按标签指示条件保存，有效期1年。
eccDNA粗提液、TE缓冲液，超纯水，75%乙醇。
一、实验前样品准备
- 用自选方法获得eccDNA粗提液，取2mL eccDNA粗提液平均分到4个1.5mL塑料管中。
二、eccDNA粗提液去蛋白
- 在上述eccDNA粗提液中，分别加入0.2mL去蛋白溶液A，再涡旋震荡2分钟。
- 常温13000×g离心5分钟，溶液将呈两层相。将含有DNA的上层转移到一个新的离心管中。
- 再加入0.2mL去蛋白溶液B，再涡旋震荡2分钟。
- 常温13000×g离心5分钟，溶液将呈两层相。将含有DNA的上层转移到一个新的离心管中。
- 在上清中加入0.9mL的微量核酸沉淀剂V2.0（需要颠倒混匀后取用），颠倒混匀，常温13000×g离心15分钟，小心弃上清后加入1mL自备75%乙醇，颠倒10次，常温13000×g离心3分钟，小心弃上清后短暂离心30秒。去掉残留的液体（约50μL）。
- 在室温下以13000×g离心0.5分钟，弃上清液。
- 加入50μL超纯水，吹打重悬，汇集在一起得到eccDNA再提液200μL，用NanoDrop或PicoGreen法DNA定量试剂盒测试eccDNA再提液浓度。取20μL eccDNA再提液留样，作为后续实验的对照。
三、线粒体DNA酶切
- 本步只限人线粒体DNA。如果用生物信息学的手段排除线粒体DNA对测序数据的干扰，可以跳过此步。eccDNA不是从人细胞提取的也可以跳过此步。
- 在一个PCR管中设置如下反应：
成分 用量 10×人mtDNA内切酶缓冲液 20μL eccDNA再提液 180μL 人mtDNA内切酶 1μL - 37℃保温4小时。
- 加入0.2mL去蛋白溶液A，再涡旋震荡2分钟。
- 常温13000×g离心5分钟，溶液将呈两层相。将含有DNA的上层转移到一个新的离心管中.
- 再加入0.2mL去蛋白溶液B，再涡旋震荡2分钟。
- 常温13000×g离心5分钟，溶液将呈两层相。将含有DNA的上层转移到一个新的离心管中。
- 在上清中加入0.2mL的微量核酸沉淀剂V2.0（需要颠倒混匀后取用），颠倒混匀，常温13000×g离心15分钟，小心弃上清后加入1mL自备75%乙醇，颠倒10次，常温13000×g离心3分钟，小心弃上清后短暂离心30秒。去掉残留的液体。
- 加入50μL TE缓冲液，吹打溶解沉淀，得到eccDNA精提液。用NanoDrop或PicoGreen法测试所得eccDNA的浓度。eccDNA精提液可用于后续各种实验。
四、去除人线粒体DNA效果检测
- 可以用自备的线粒体PCR试剂盒，以eccDNA再提液留样和eccDNA精提液为模板进行扩增，检测去除线粒体DNA的效果。本试剂盒不含人线粒体DNA检测试剂盒，用户需要另外购买。本步也可以跳过。
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